邻近连接技术（Proximity Ligation Assay，PLA）是一种高灵敏度的分子检测方法，主要用于单细胞水平上研究蛋白质相互作用。该技术通过特异性抗体识别并结合目标蛋白，随后使用携带寡聚脱氧核苷酸（单链DNA）的PLA探针与抗体结合。当两个目标蛋白相互靠近时，其对应的PLA探针DNA片段会互补配对，并在连接酶的作用下形成一个环状结构，通过滚环扩增（RCA）生成可检测的信号。该方法依赖于探针对近距离（<40nm）目标分子的识别，将蛋白质的检测转化为DNA核酸序列的检测，从而实现对特定蛋白质的检测、定量及定位。

与传统的Co-IP验证蛋白互作技术相比，PLA技术不仅能够观测到细胞中互作蛋白的具体区域，而且可与病理技术结合，观察特定细胞内的蛋白互作情况。通过荧光强度可以反映蛋白互作的强弱，为蛋白互作的可视化提供支持。

PLA实验的经典流程如下：

(1) 样本处理：将多聚甲醛固定后的细胞爬片或石蜡包埋的组织样本切片进行脱蜡处理。

(2) 封闭：在细胞爬片或组织切片上滴加均匀的封闭液，以确保覆盖整个组织区域。

(3) 孵育一抗：在已封闭的细胞爬片或者组织切片上均匀滴加稀释后的一抗，放入湿盒内于37°C孵育以便充分结合。

(4) 孵育PLA探针：清洗后加入PLUS和MINUS两种PLA探针。

(5) 连接反应：加入含连接酶的连接缓冲液，将载玻片放于预热的湿盒内于37°C进行连接反应。

(6) 扩增及成像：清洗掉连接缓冲液后，加入含聚合酶的扩增缓冲液，并使用荧光显微镜观察目标蛋白的相互作用。

#### PLA在蛋白互作研究中的应用

PLA技术结合抗体的特异性和PCR的灵敏性，能够高度敏感地检测蛋白质相互作用。例如，有研究利用PLA技术发现Jurkat细胞中ZAP-70和TCRzeta蛋白的互作，主要发生在细胞质中。这一研究清晰地展示了PLA在揭示蛋白相互作用中的重要性。

#### PLA在组织样本中的应用

成如LRRK2激酶在帕金森病中扮演着重要调控角色，其活性依赖于pS1292蛋白的磷酸化。研究者运用PLA技术观察LRRK2与pS1292蛋白在帕金森大鼠脑内多巴胺神经元中的互作情况。通过标记多巴胺神经元，研究者能够显示出在鱼藤酮处理后，LRRK2激酶与pS1292的显著互作情况，相较于未处理组有了更为明显的变化。

#### PLA在蛋白与RNA互作研究中的应用

除了蛋白与蛋白的验证，PLA技术还可用于蛋白与RNA的互作的研究。研究者可以合成带有生物素标记的RNA探针并转染入细胞，随后按照经典的PLA步骤进行，最终观察蛋白与RNA的相互作用。

例如，cMYC的mRNA含有多个ARE结构域，有研究探讨FXR1蛋白在cMYC mRNA上结合的相关区段，重要发现显示FXR1蛋白主要结合在特定的mRNA片段中，这为研究cMYC的功能调控提供了有力的证据。

尊龙凯时在生物医药领域的研究正在不断深入，PLA技术的应用前景广泛，未来将促进微量样本的弱互作检测、单细胞蛋白互作及疾病标志物的发现等多项研究的快速发展。随着技术的不断进步，PLA将在更多领域展现其重要的应用价值。