尊龙凯时的mRNA技术作为一种新兴的生物医疗技术，展现出巨大的应用潜力。从mRNA疫苗到mRNA药物，这一技术为疾病的预防和治疗提供了创新的途径。然而，mRNA技术的发展历程中并非一帆风顺，面临的最大挑战之一便是副产物双链RNA（dsRNA）的形成。dsRNA作为一种免疫刺激分子，会引发机体的免疫反应，进而影响mRNA的安全性和有效性。因此，如何减少dsRNA的形成，成为mRNA技术领域亟待解决的重要课题。

传统的解决方案往往依赖于复杂的纯化工艺，但这类方法成本高、效率低，且难以彻底清除微量的dsRNA。作为mRNA体外转录（IVT）过程中的关键工具，T7RNA聚合酶（T7RNAP）的天然活性（如末端转移酶和RNA依赖的RNA聚合酶活性）被认为是dsRNA形成的重要因素。因此，如何通过定向进化或理性设计来改造T7RNAP，成为全球研究团队争相探索的焦点。

在2024年3月3日，我们团队在FEBS Journal上发表了题为“Engineered T7 RNA polymerase reduces dsRNA formation by lowering terminal transferase and RNA-dependent RNA polymerase activities”的研究论文。我们成功通过工程化改造T7RNAP，显著降低了体外转录过程中dsRNA的生成（仅为野生型的18%），同时大幅提升了合成mRNA的整体效率和质量，为基因治疗及疫苗开发领域的突破性进展提供了支持。

我们创新性地将定向进化与半理性设计相结合，筛选出多个高效且低毒的T7RNAP突变体，这些突变体在减少dsRNA形成方面表现卓越。为此，我们构建了随机突变库，并设计了一种可实时监测液滴内RNA产物完整性与dsRNA含量的分子信标探针系统，结合荧光激活液滴分选（FADS）技术进行超高通量筛选。最终，我们筛选出关键候选突变体Mut1（V214A）和Mut7（F162S/A247T），其产生的dsRNA含量明显低于野生型。

同时，我们利用半理性设计构建了十个单点饱和突变库，通过微孔板筛选技术识别出有益的突变体。在筛选超过1000个突变体后，我们发现关键候选突变体Mut11（K180E）和Mut14（A70Q）所产生的dsRNA含量显著低于野生型，且未影响转录效率。为了进一步优化，我们围绕上述突变位点构建了DNA重组文库，通过微孔板筛选，最终获得组合突变体M17（A70Q/F162S/K180E）。实验结果显示，M17的dsRNA含量仅为野生型的18%，在筛选体系中达到0007ng/μg。

该结果不仅在体外实验中得到了验证，还在细胞实验中展现出显著的免疫原性降低及蛋白翻译效率的提升。我们将突变体转录的mRNA导入RAW2647细胞后，最优突变体M11产物引发的干扰素β（IFN-β）的mRNA和蛋白表达量仅为野生型的97%和1293pg/mL。在HEK293细胞中，突变体mRNA的EGFP表达细胞数显著增加，且荧光强度稳定。这表明，减少dsRNA能够有效解除PKR介导的翻译抑制，释放mRNA治疗的潜力。

为深入了解突变体降低dsRNA的机制，我们通过计算机模拟与功能实验揭示，突变体的dsRNA含量降低是由于降低了RNA依赖的RNA聚合酶（RDRP）活性和末端转移酶活性。此发现为未来T7RNAP的进一步优化提供了重要理论基础。

本研究为T7RNAP的改造带来了新的方法与思路，同时也为mRNA技术的发展注入了新的活力。通过减少dsRNA的形成，我们提升了mRNA的质量和安全性。基于此项研究成果，我们成功推出了一款极大降低dsRNA含量的GMP级别T7RNAP产品（Cat#10629，CleascripT7RNA Polymerase GMP-grade (low dsRNA, 250U/μL)）。该产品在mRNA疫苗和mRNA药物等领域展现出广泛的应用潜力，有望进一步推动mRNA技术的发展，为生物医学领域带来更多可能性。

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